ABSTRACT This research is aimed to evaluate the effect of copper on biomass growth, laccase activity and isoenzymes composition of Pleurotus sajor-caju, and its ability to grow on effluents of the citrus industry. The inhibitory effect of copper on growth was evidenced especially after 14 days of culture in the presence of the highest concentration of copper (1 mM) reducing almost three times its growth. The highest enzyme activity was reached at the 10th day of treatment, with ~ 53 U/L for the medium without copper and ~ 121 and ~ 68 U/L for medium supplemented with 0.5 and 1mM, respectively. Laccases in cell-free extracts obtained from culture added with copper showed to be more stable for more time at temperature changes. The optimum temperature for laccase activity increased from 50 to 60 ºC by effect of copper while the optimal pH was 5 in all experiments. In gels, it was possible to observe two isoenzymes of 65 and 35 kDa whose expression varied according to incubation time. Moreover, the isoenzyme of low molecular weight was induced by the presence of effluent in solid medium. P. sajor-caju had the ability to grow on effluents from the citrus industry, showing tolerance and potential for waste treatment, constituting a possible alternative to biodegrade and reduce the contaminating impact of effluents.

RESUMEN Esta investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto del cobre en el crecimiento de la biomasa, la actividad de lacasas y la composición de isoenzimas de Pleurotus sajor-caju, así como su capacidad para crecer en los efluentes de la industria citrícola. El efecto inhibidor del cobre sobre el crecimiento se evidenció especialmente después de 14 días de cultivo en presencia de la mayor concentración de cobre (1 mM), reduciendo casi tres veces el crecimiento. La actividad enzimática más alta se alcanzó a los 10 días para todos los tratamientos, con ~ 53 U/L para el medio sin cobre y ~ 121 U/L y ~ 68 U/L para los medios suplementados con 0.5 y 1 mM, respectivamente. Las lacasas en los extractos libres de células obtenidas del cultivo agregado con cobre mostraron ser más estables por más tiempo a los cambios de temperatura. La temperatura óptima para la actividad de lacasas aumentó de 50 a 60 ºC por efecto del cobre, mientras que el pH óptimo fue de 5 en todos los experimentos. En los geles fue posible observar dos isoenzimas de 65 y 35 kDa cuya expresión varió según el tiempo de incubación. Además, la isoenzima de bajo peso molecular fue inducida por la presencia de efluente en medio sólido. P. sajor-caju fue capaz de crecer en el efluente de la industria citrícola, demostrando tolerancia y un potencial para el tratamiento de residuos, constituyendo una posible alternativa para biodegradar y reducir el impacto contaminante de los efluentes.

Abstract Oxidative enzymes secreted by white rot fungi can be applied in several technological processes within the paper industry, biofuel production and bioremediation. The discovery of native strains from the biodiverse Misiones (Argentina) forest can provide useful enzymes for biotechnological purposes. In this work, we evaluated the laccase and manganese peroxidase secretion abilities of four newly discovered strains of Trametes sp. that are native to Misiones. In addition, the copper response and optimal pH and temperature for laccase activity in culture supernatants were determined.The selected strains produced variable amounts of laccase and MnP; when Cu2+ was added, both enzymes were significantly increased. Zymograms showed that two isoenzymes were increased in all strains in the presence of Cu2+. Strain B showed the greatest response to Cu2+ addition, whereas strain A was more stable at the optimal temperature and pH. Strain A showed interesting potential for future biotechnological approaches due to the superior thermo-stability of its secreted enzymes.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial para producir enzimas ligninolíticas de diversas cepas de hongos de pudrición blanca, nativas de la Provincia de Misiones (Argentina). Coriolus versicolor v. antarcticus BAFC 266, Pycnoporus sanguineus BAFC 2126 y Phlebia brevispora BAFC 633 mostraron un gran potencial para producir fenoloxidasas. En Ganoderma applanatum cepa E, P. sanguineus BAFC 2126 y P. brevispora BAFC 633 se observó una marcada actividad lacasa y peroxidasa. C. versicolor v. antarcticus. G. applanatum (cepa A) y Trametes villosa, mostraron una reacción oxidativa altamente positiva sobre 2,6-dimetoxifenol a pH 4. C. versicolor v. antarcticus, G. applanatum (cepas D y F), T. elegans BAFC 2127 y T. villosa, mostraron una alta actividad manganeso peroxidasa y solo C. versicolor v. antarcticus mostró una alta actividad de lignino peroxidasa. La actividad tirosinasa fue evidente en las cepas D y F de G. applanatum y en Phanerochaete chrysosporium HHB 11741. La decoloración del licor negro Kraft reveló una actividad ligninolítica variable para las diferentes cepas estudiadas dependiendo de la concentración utilizada. Algunos hongos mostraron una moderada actividad ligninolítica con grandes halos de decoloración (p.e. Pleurotus sajor-caju y Steccherinium sp. BAFC 1171) indicando un significativo potencial para el aprovechamiento biotecnológico de estas cepas.

This research aimed to evaluate the potential of several native white rot fungi (WRF) isolated from subtropical environments of Misiones (Argentina) to produce different ligninolytic enzymes. Coriolus versicolor f. antarcticus BAFC 266, Pycnoporus sanguineus BAFC 2126 and Phlebia brevispora BAFC 633 showed the highest phenoloxidase activity. Ganoderma applanatum strain E, P. sanguineus BAFC 2126 and P. brevispora BAFC 633 revealed marked laccase and peroxidase activity. C. versicolor f. antarcticus, G. applanatum (strain A) and Trametes villosa, gave high positive reactions with 2,6-dimethoxyphenol oxidation at the lowest tested pH. C. versicolor f. antarcticus, G. applanatum strains D and F, T. elegans BAFC 2127and T. villosa, showed the highest manganese peroxidase activity. C. versicolor f. antarcticus also produced the highest lignin peroxidase activity. Tyrosinase activity was mostly evident in G. applanatum strains (D and F) and Phanerochaete chrysosporium HHB 11741. Kraft liquor decolorization results were variable and depended on the fungus and the liquor concentration. Some fungi with moderate ligninolytic activity showed high decolorization rates (e.g. Pleurotus sajor-caju and Steccherinium sp. BAFC 1171) indicating the significance of additional approach to evaluate a potential biotechnological application.

In Misiones two species of genus Ilex prevail: I. paraguariensis and I. dumosa, but only the first one should be used to manufacture yerba mate products. I. dumosa is frequently used in mixtures with I. paraguariensis, although amounts above 1% are considered adulterants. From the technological perspective, it is feasible to differentiate them through the use of molecular markers such as ITS regions of ribosomal DNA. The aim of this work was to optimize a molecular technique to detect I. dumosa in yerba mate packages when it could be found as adulterant. Fresh leaves and thirteen trademarks of yerba mate and yerba canchada were used for the experience. For primers design ITS regions of I. dumosa were used and amplification conditions were standardized and products were sequenced. The technique sensitivity and specificity were 93.3% and 100% respectively, with a detection limit of 1% w / w. The technique was validated through the analysis of commercial and artificially adulterated samples and no traces of I. dumosa were detected in all commercial packages tested.

En la provincia de Misiones predominan dos especies del género Ilex: I. paraguariensis e I. dumosa, pero solo la primera debe ser utilizada para la elaboración del producto yerba mate. I. dumosa es frecuentemente utilizada en mezclas con I. paraguariensis, aunque en cantidades superiores al 1% son consideradas adulterantes. Desde el punto de vista tecnológico es factible diferenciarlas a través del uso de marcadores moleculares como las regiones ITS del DNA ribosómico. El objetivo del trabajo fue diseñar una técnica molecular que permita detectar I. dumosa en paquetes de yerba mate cuando esta se encuentre como adulterante. Para ello se trabajó con hojas frescas, 13 marcas comerciales de yerba mate elaborada y yerba canchada. Para el diseño de los cebadores se utilizaron las regiones ITS de I. dumosa y se estandarizaron las condiciones de amplificación, los resultados fueron chequeandos mediante secuenciación. La sensibilidad del método fue de 93,3% y la especificidad de 100%, con un límite de detección de 1% p/p. La técnica fue validada a través del análisis de muestras comerciales y artificialmente adulteradas, sin encontrarse rastros del contaminante en ninguno de los paquetes comerciales testeados.

Provincia de Misiones posee actualmente una actividad forestal en pujante crecimiento ubicándose entre las primeras del país. Este marco de desarrollo productivo permite predecir un ámbito de crecimiento favorecido por las nuevas condiciones del mercado internacional. Por otro lado a pesar del avance de la tecnología industrial, no se ha alcanzado el nivel de desarrollo biotecnológico óptimo que conjugue la calidad genética con características fenotípicas de excelencia en las especies maderables de mayor demanda en la Provincia basándose la selección en criterios netamente fenotípicos y en la experiencia del productor, sin contarse con métodos moleculares desarrollados en la región. Este trabajo presenta los resultados del Proyecto Federal de Innovación Productiva (PFIP Mi09) cuyo objetivo principal fue estandarizar y transferir al sector productivo un conjunto de marcadores moleculares microsatélites para ser aplicado al análisis de poblaciones y forestaciones de Araucaria angustifolia y Pinus taeda provenientes de la Provincia de Misiones (Argentina). Esto permitirá conocer el perfil genético de plantaciones y poblaciones de estas especies forestales, pudiendo aplicarse a la certificación de calidad en la producción forestal o a la selección de ejemplares de especies nativas.

Misiones Province currently has the first intensive forestry activity of Argentine. This framework of productive development allows predict an area of growth favored by the new conditions of the international market. On the other side despite the progress of industrial technology, has not been reached the optimal level of biotechnological development that combining quality with genomic and phenotypic characteristics of forest species. This work presents the results of Federal Project of Productive Innovation (PFIP Mi09) whose main objective was standardize and transfer to the productive sector a set of microsatellites molecular markers to be applied to the populations analysis of Araucaria angustifolia and Pinus taeda forestation from the Misiones (Argentine). This will reveal the plantations and forest genetic profile and may be applied to genetic certification of forest production quality.